ABSTRAK
Mempelajari gangguan neurologis secara in vitro tetap menjadi tantangan karena kompleksitas otak manusia dan terbatasnya ketersediaan sel saraf primer. Rekayasa jaringan memungkinkan pengembangan sistem kultur sel tiga dimensi (3D) dengan menghasilkan substrat matriks ekstraseluler (ECM) yang diproduksi sendiri. Membudidayakan sel dalam substrat ECM ini diketahui lebih efektif meniru kondisi fisiologis dibandingkan dengan kultur monolapis tradisional. Dalam penelitian ini, kami menganalisis proteom dan matrisom fibroblas dermal yang dikultur 3D yang tertanam dalam ECM yang diproduksi sendiri. Menariknya, analisis in silico memprediksi aktivasi kuat fungsi terkait neurogenesis dalam model 3D rekayasa jaringan ini. Kami menunjukkan bahwa protein ECM yang biasanya terkait dengan perkembangan dan pemeliharaan neuronal juga diekspresikan oleh fibroblas dermal. Membudidayakan fibroblas dermal dengan neuron motorik yang berasal dari sel induk pluripoten terinduksi (iPSC) secara signifikan memungkinkan periode kultur yang berlangsung lama sekaligus meminimalkan kematian neuronal, semuanya tanpa memerlukan suplemen media yang mahal. Lebih jauh lagi, media yang dikondisikan dengan fibroblas meningkatkan kelangsungan hidup neuron. Meskipun kami menunjukkan bahwa ECM yang berasal dari fibroblas dermal menyediakan matriks protein dan molekul pensinyalan yang kaya yang mendukung pertumbuhan dan kelangsungan hidup neuron, ECM saja tampaknya tidak cukup untuk mempertahankan jaringan neuron. Temuan ini menunjukkan bahwa fibroblas dermal yang berasal dari pasien yang dikultur 3D menghasilkan lingkungan mikro yang mendukung saraf dan dapat berfungsi sebagai alternatif yang hemat biaya dan kurang invasif untuk biopsi otak untuk memodelkan gangguan neurologis yang kompleks. Pendekatan ini menawarkan platform yang menjanjikan untuk mempelajari pertumbuhan dan kelangsungan hidup saraf tersebut dan mengeksplorasi strategi terapeutik untuk penyakit neurologis.
1 Pendahuluan
Penyakit neurologis mencakup banyak kondisi kompleks dan melemahkan yang memengaruhi sistem saraf pusat (SSP), yang sering ditandai dengan hilangnya neuron dan defisit fungsional [1]. Meskipun ada upaya penelitian yang signifikan, pilihan pengobatan yang efektif untuk banyak penyakit neurologis masih terbatas. Saat ini, berbagai metode in vitro digunakan untuk mempelajari penyakit neurologis. Namun, pemodelan otak manusia in vitro merupakan pendekatan kompleks yang memerlukan manipulasi sel saraf secara cermat dan pemahaman mendalam tentang jalur pensinyalan kompleks dan interaksi yang terjadi di SSP [2]. Meskipun kultur sel dua dimensi (2D) telah lama menjadi standar, penelitian terkini semakin berfokus pada pendekatan kultur sel tiga dimensi (3D) yang menawarkan lingkungan mikro biokimia dan biomekanik yang lebih realistis. Memang, sel saraf yang diperoleh dari berbagai sumber dapat dikultur dalam lingkungan 3D yang meniru struktur dan komposisi otak [3]. Lingkungan seperti itu dapat dicapai dengan menggunakan berbagai teknik dan pendekatan kultur sel, menggunakan perancah atau hidrogel, yang memberikan dukungan fisik bagi sel untuk tumbuh [4, 5]. Pemodelan 3D menawarkan banyak keuntungan dibandingkan kultur monolayer 2D tradisional, seperti kultur simultan dari berbagai jenis sel, dan adanya interaksi sel-ke-sel dan sel-ke-matriks ekstraseluler (ECM) [6, 7].
ECM adalah jaringan makromolekul kompleks yang terdiri dari protein berserat, seperti kolagen dan polisakarida. Di otak, ECM mengisi ruang antara neuron dan sel glia, dan terdiri dari sekitar 20% dari total volume otak dewasa, sedangkan volumenya dapat berlipat ganda selama perkembangan [8]. Di luar peran strukturalnya dalam SSP, ECM mengatur berbagai proses saraf penting selama perkembangan otak dan berkontribusi pada kondisi fisiologis dan patologis di otak dewasa. Ini termasuk migrasi sel, pertumbuhan neurit, diferensiasi, sinaptogenesis, plastisitas sinaptik, dan kelangsungan hidup [9, 10]. Sel berinteraksi dengan komponen inti ECM, seperti kolagen, fibronektin, laminin, dan proteoglikan, melalui reseptor transmembran, di antaranya integrin adalah yang paling menonjol. Interaksi ini menghasilkan transmisi berbagai sinyal dan modulasi perilaku dan kelangsungan hidup sel [11, 12]. ECM inti mengalami perombakan dinamis, dengan perubahan komposisi, organisasi, dan kekakuan [13]. Selain komponen inti ECM, protein terkait ECM memainkan peran penting dalam mengatur fungsi seluler dalam SSP. Protein ini mencakup berbagai molekul seperti protein yang berafiliasi dengan ECM, enzim perombakan ECM, dan faktor yang disekresikan seperti faktor pertumbuhan dan sitokin. Protein tersebut berkontribusi pada integritas struktural ECM dan berpartisipasi dalam jalur persinyalan yang mengatur perkembangan dan fungsi saraf. Bersama-sama, ECM inti dan protein terkait ECM membentuk jaringan kompleks yang dikenal sebagai “matrisom,” yang mengatur interaksi dinamis antara sel saraf dan lingkungan mikro. Selain peran penting dalam perkembangan normal, perubahan pada matrisome telah dikaitkan dengan berbagai penyakit neurologis [14]. Gangguan pada komposisi, organisasi, atau sifat pensinyalan matrisome telah dikaitkan dengan berbagai kondisi, termasuk gangguan perkembangan saraf seperti gangguan spektrum autisme, serta penyakit neurodegeneratif seperti penyakit Alzheimer, penyakit Parkinson, dan sklerosis lateral amiotrofik (ALS) [15]. Disregulasi enzim remodeling ECM, deposisi abnormal protein ECM, atau aktivasi abnormal jalur pensinyalan terkait ECM dapat membahayakan konektivitas neuronal, fungsi sinaptik, dan homeostasis otak secara keseluruhan. Oleh karena itu, pengembangan model in vitro yang akurat untuk mempelajari dinamika ECM dalam konteks gangguan neurologis sangat penting untuk mengidentifikasi target terapi baru dan merancang intervensi yang efektif untuk memulihkan homeostasis ECM.
Meskipun studi in vitro sering menggunakan protein ECM yang dimurnikan untuk pelapis kultur sel, sebenarnya tidak ada model in vitro yang dapat menangkap kompleksitas molekuler dan heterogenitas penuh ECM otak [16]. Namun, mereproduksi kompleksitas dan keragaman rumit ECM otak secara in vitro dapat meningkatkan relevansi dan penerapan studi tersebut secara signifikan. Model kulit rekayasa jaringan, yang dibuat menggunakan pendekatan perakitan mandiri dengan fibroblas pasien sendiri, sebelumnya telah terbukti merangkum fitur neuropatologis spesifik ALS [17] dan Neurofibromatosis Tipe 1 (NF1) [18, 19]. Selama perkembangan embrio, baik otak maupun kulit berasal dari lapisan germinal ektodermal [20, 21]. Meskipun otak dan kulit berdiferensiasi menjadi struktur yang berbeda, kedua jaringan ini dapat berbagi jalur pensinyalan molekuler dan proses perkembangan yang sama. Memahami dinamika rumit komponen matrisom sangat penting untuk menjelaskan patofisiologi gangguan neurologis. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami melakukan analisis siliko mendalam terhadap matrisom dermis yang dirakit sendiri secara 3D. Melalui analisis ini, kami bertujuan untuk memvalidasi lebih lanjut kegunaan model rekayasa jaringan 3D bebas perancah yang terbuat dari fibroblas dermal dan ECM yang diproduksi sendiri untuk mempelajari penyakit neurologis secara in vitro. Data ini berpotensi memberikan wawasan tentang mekanisme molekuler dan seluler yang mendasari yang mengatur proses neurogenik.
2 Bahan dan Metode
2.1 Isolasi dan Kultur Fibroblas Manusia
Fibroblas dermal diisolasi dari biopsi tusuk kulit berukuran 6 mm yang diambil dari daerah tubuh yang sama untuk setiap individu yang direkrut seperti yang dijelaskan sebelumnya [17]. Sel dikultur dalam modifikasi Dulbecco–Vogt dari medium Eagle (DMEM; Invitrogen) yang dilengkapi dengan 10% serum sapi fetal (FBS; VWR), dan campuran antibiotik yang terdiri dari 100 IU/mL penisilin G (MilliporeSigma) dan 25 µg/mL gentamisin (MilliporeSigma). Sel dipelihara dalam inkubator pada suhu 37°C dan 8% CO2 dan medium diganti tiga kali seminggu. Semua percobaan dilakukan menggunakan fibroblas pada maksimum lima lintasan.
2.2 Dermis yang Direkayasa Jaringan dan Ekstraksi Protein Total
Dermis 3D diproduksi menggunakan pendekatan perakitan mandiri rekayasa jaringan seperti yang dijelaskan sebelumnya [18]. Secara singkat, 150.000 fibroblas dermal disemai dalam pelat 6-sumur dan dikultur dalam DMEM lengkap yang dilengkapi dengan 50 µg/mL asam askorbat (MilliporeSigma) untuk meningkatkan sekresi dan perakitan ECM. Sel dikultur selama 28 hari dalam inkubator pada suhu 37°C, 8% CO2, dan kelembapan relatif 95%. Media diganti tiga kali seminggu. Dermis yang direkonstruksi 3D dibekukan dengan cepat lalu dihaluskan dengan peralatan CryoMill (Retsch). Untuk kultur sel 2D, fibroblas dipertahankan dalam satu lapisan hingga mencapai konfluensi 70%. Selanjutnya, sel dipanen, dan protein diekstraksi menggunakan buffer TNG-T (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% gliserol, dan 1% triton X-100).
2.3 Media Terkondisi dan Ekstraksi Total Protein yang Disekresikan
Untuk fibroblas kultur 2D dan 3D, sel-sel mengalami deprivasi serum selama 48 jam sebelum mengumpulkan supernatan. Media terkondisi disentrifugasi selama 20 menit pada 2000 × g untuk menghilangkan serpihan sel. Total protein diendapkan menggunakan teknik presipitasi protein trikloroasetat-natrium deoksikolat [22].
2.4 Kromatografi Cair Skala Nano yang Digabungkan dengan Spektrometri Massa Tandem
Total protein diekstraksi dari sel dan media yang dikondisikan, dikumpulkan dengan sentrifugasi, dan dicuci dengan aseton. Pelet dilarutkan dalam buffer amonium bikarbonat-natrium deoksikolat, dan konsentrasi protein diukur menggunakan uji Bradford (Bio-Rad). Protein direduksi dengan DTT, dialkilasi dengan iodoasetamida, dan dicerna dengan tripsin semalaman. Reaksi dihentikan dengan asam format, dan peptida dimurnikan menggunakan pelat SOLAμ (Thermo Fisher Scientific) lalu dikeringkan dengan vakum. Sistem nanoLC-MS/MS yang berisi kromatografi cair U3000 NanoRSLC (Thermo Fisher Scientific) yang sejalan dengan spektrometer massa Orbitrap Fusion Tribrid–ETD (Thermo Fisher Scientific), digerakkan oleh Aplikasi Orbitrap Fusion Tune (v. 3.3.2782.34), dan dilengkapi dengan sumber ion Nanospray Flex digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur jumlah protein seperti yang dijelaskan sebelumnya [23].
2.5 Bioinformatika
Data mentah diproses dengan NetworkAnalyst 3.0 [24]. Protein dengan varians rendah (persentil ke-15) dan kelimpahan rendah (persentil ke-5) disaring. Kemudian, data dinormalisasi menggunakan transformasi Log2 dan diserahkan ke analisis statistik Limma untuk mengevaluasi signifikansi statistik regulasi protein. Proses biologis dan analisis pengayaan jaringan dilakukan dengan memasukkan simbol protein yang diatur secara signifikan ke dalam basis data proses biologis Gene Ontology (GO) melalui alat daring EnrichR [25], dan analisis pengayaan DAVID [26] menggunakan alat jaringan normal Human Protein Atlas (HPA) [27]. Selain itu, prediksi regulasi dan interaksi protein secara silico dibuat dan dieksplorasi menggunakan perangkat lunak Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Qiagen) [28].
2.6 Diferensiasi iPSC Menjadi Neuron Motorik
Sel punca pluripoten terinduksi (iPSC) diperoleh dari platform iPSC-Quebec dari Pusat Penelitian CHU de Québec-Université Laval. iPSC diprogram ulang dari sel limfoblastoid manusia yang sehat dengan CytoTune-2.0 Sendai Reprogramming Kit (Invitrogen) mengikuti protokol pabrik pembuatnya. Diferensiasi iPSC menjadi neuron motorik (MN) dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [29].
2.7 Kultur MN dalam Dermis 3D
Untuk mengkultur MN dalam dermis fibroblas 3D, 150.000 fibroblas dermal disemai dalam pelat 12-sumur dan dikultur dalam DMEM lengkap yang dilengkapi dengan 50 µg/mL asam askorbat (MilliporeSigma). Jangkar kertas dan pemberat ditambahkan ke pelat kultur, dan sel dikultur selama 21 hari dalam inkubator pada suhu 37°C, 8% CO2, dan kelembapan relatif 95%. Media diganti tiga kali seminggu. Sebanyak 131.000 MN/cm2 (pada Hari ke-18 diferensiasi) kemudian disemai ke lembaran fibroblas dermal. MN dikultur dalam 3D selama 7 hari dengan medium diferensiasi MN, medium fibroblas (DMEM lengkap yang dilengkapi dengan 50 µg/mL asam askorbat), atau rasio 1:1 dari kedua medium. Lembaran fibroblas kemudian ditumpuk di atas dermis fibroblas 3D yang mengandung MN dan dikultur selama 10 hari tambahan dalam kondisi yang sama (Gambar 5A).
2.8 Imunofluoresensi
MN yang dikultur dalam 2D pada Hari ke-18 diferensiasi dan dalam dermis 3D pada Hari ke-38 difiksasi dengan 4% paraformaldehida (Electron Microscopy Sciences) selama 30 menit pada suhu 4°C. Sampel diblokir dan dipermeabilisasi selama 1 jam pada suhu kamar dalam buffer yang mengandung garam penyangga fosfat (PBS), 0,3% Triton X-100 (Bio-Rad), dan 5% serum kambing (Invitrogen). Untuk MN 2D, sel diinkubasi semalam pada suhu 4°C dengan antibodi primer spesifik terhadap anti-neurofilamen M (NF-M; 1:500; MilliporeSigma) dan anti-Islet-1 (1:500; Abcam). Untuk kultur 3D, hanya NF-M (1:500; MilliporeSigma) yang digunakan. Setelah dicuci, sampel diinkubasi selama 2 jam dengan antibodi sekunder: anti-ayam keledai berlabel Alexa Fluor 594 (1:1000; Invitrogen) untuk NF-M, anti-kelinci kambing berlabel Alexa Fluor 488 (1:1000; Invitrogen) untuk Islet1, dan Hoechst 33342 (1:100; MilliporeSigma) untuk pewarnaan ulang nuklir. Gambar diambil menggunakan mikroskop confocal LSI 700 dengan Zeiss Axio Imager (Carl Zeiss Microscopy).
2.9 Uji Hidup/Mati
Pada Hari ke-11 protokol diferensiasi, 200.000 MN/cm2 ditanam pada 12 pelat sumur yang diberi perlakuan dengan 50 µg/mL poli-d-lisin (MilliporeSigma). Sel dikultur selama 7 hari dengan media MN sesuai dengan protokol yang dijelaskan di Bagian 2.8. Pada Hari ke-18 diferensiasi, MN diberi perlakuan selama 48 jam dengan rasio media terkondisi yang berbeda yang dikumpulkan dari fibroblas yang dikultur dalam media diferensiasi 3D dan MN. Kit Viabilitas/Sitotoksisitas Hidup/Mati untuk sel mamalia (Thermo Fisher Scientific) digunakan untuk menilai viabilitas dan apoptosis sebagaimana dirinci oleh prosedur pabrik. Gambar diambil menggunakan mikroskopi konfokal. Persentase MN hidup dan mati dihitung dengan perangkat lunak ImageJ. Analisis varians satu arah biasa (ANOVA) dilakukan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 10.2.3. Tingkat signifikansi ditetapkan pada nilai p < 0,05. 3
3. Hasil
3.1 Bentang Alam Proteomik Diferensial Fibroblas Dermal dalam Kultur 3D
Pertama-tama kami melakukan analisis proteomik untuk mengidentifikasi protein yang diekspresikan secara berbeda yang unik untuk konteks 3D dibandingkan dengan kultur 2D standar. Rata-rata, 3059 protein diidentifikasi, dengan nilai yang hilang bervariasi antara 23,54% dan 33%, menghasilkan tingkat ketidakhadiran yang dapat diterima secara keseluruhan sebesar 28,03% untuk kumpulan data (Gambar 1A). Untuk mengatasi hal ini, nilai yang hilang diimputasikan dengan nilai derau yang sesuai dengan persentil 0,01 dari distribusi intensitas untuk setiap sampel, meningkatkan keandalan data seperti yang dijelaskan sebelumnya [30]. Dari protein yang diidentifikasi, 2785 dibagi antara kultur fibroblas monolayer 2D dan 3D (Gambar 1B). Sebanyak 69 protein eksklusif untuk sel kultur 2D, sementara 207 protein unik untuk kultur fibroblas 3D. Dari protein yang diidentifikasi, 2206 menunjukkan tingkat ekspresi yang cukup untuk kuantifikasi yang akurat. Analisis komponen utama (PCA) dan analisis peta panas mengonfirmasi pemisahan sampel yang jelas berdasarkan kelompok (Gambar 1C, D). PCA mengungkapkan bahwa dua komponen utama pertama menjelaskan sebagian besar varians, dengan PC1 menjelaskan 88,1% dan PC2 sebesar 5,1%, menyoroti perbedaan utama antara pendekatan kultur yang dipilih (2D vs. 3D). Akhirnya, kumpulan data yang dianalisis terdiri dari 1704 protein yang lolos penyaringan varians dan kelimpahan rendah. Analisis ekspresi protein diferensial, menggunakan nilai p yang disesuaikan di bawah 0,05 dan perubahan lipatan (FC) sama atau lebih besar dari 2 (Log2FC > 1), mengidentifikasi 298 protein yang meningkat secara signifikan dan 368 yang menurun secara signifikan dalam kultur fibroblas 3D (Gambar 1E, Tabel S1). Analisis proteomik dari seluruh protein yang dikumpulkan dari media terkondisikan mengungkapkan tren yang serupa (Gambar S1). Pengelompokan PCA juga menunjukkan pemisahan kelompok yang jelas, dengan PC1 menjelaskan 74% varians yang dikaitkan dengan pendekatan kultur (Gambar S1A). Secara keseluruhan, 425 protein yang disekresikan dikuantifikasi, dengan 70 protein yang diatur naik dan 141 protein yang diatur turun (Gambar S1C dan Tabel S2). Analisis komparatif protein yang diproduksi dan dilepaskan oleh sel yang sama mengidentifikasi 298 protein bersama, yang 30 menunjukkan peningkatan ekspresi dan 8 menunjukkan penurunan ekspresi (Gambar S1D). Secara kolektif, temuan ini menunjukkan bahwa kultur 3D secara signifikan memengaruhi ekspresi protein fibroblas, sebagaimana tercermin baik dalam protein yang terkait dengan sel maupun dalam media terkondisi.
3.2 Fibroblas yang Dikultur 3D Mengungkap Ekspresi Protein Spesifik Jaringan yang Terkait dengan Fungsi ECM dan Neurogenesis
Untuk mengidentifikasi jalur biologis yang diperkaya secara signifikan yang terkait dengan kultur fibroblas 3D, kami melakukan analisis pengayaan GO pada kumpulan data kami hanya menggunakan protein yang diekspresikan secara berlebihan. 40 proses biologis GO teratas ditunjukkan pada Gambar 2A. Analisis kami menunjukkan bahwa protein yang diatur naik sangat terkait dengan ECM. Proses biologis yang mendapat peringkat teratas adalah organisasi matriks ekstraseluler dan mencakup banyak kolagen. Proses lain yang terkait dengan organisasi ECM, adhesi, perakitan, biosintesis, dan katabolisme juga dikaitkan dengan protein yang diatur naik. Selain itu, proses biologis lain yang terkait dengan proliferasi dan migrasi sel, serta regulasi angiogenesis diidentifikasi. Untuk lebih memahami implikasi fungsional dari protein yang diatur naik, kami menggunakan perangkat lunak IPA untuk memprediksi aktivasi atau penghambatan berbagai fungsi ECM menggunakan seluruh kumpulan data ekspresi protein diferensial (Gambar 2B). Profil ekspresi protein menunjukkan aktivasi pembentukan, akumulasi, pengendapan, dan mineralisasi ECM, sekaligus memprediksi penghambatan adhesi, pengikatan, pengembangan, pengorganisasian, dan pembongkaran ECM. Analisis pengayaan GO dari proses biologis dengan protein signifikan yang dibagi dengan sekretom dilakukan, yang juga mengungkap banyak fungsi yang terkait dengan ECM.
3.3 Analisis In Silico Menghubungkan Protein Matrisomal dari Fibroblas yang Dikultur 3D dengan Neurogenesis
Untuk lebih menyempurnakan analisis, kami melakukan pemeriksaan yang lebih terfokus terhadap kandungan protein matrisom dan dampak in silico yang diprediksi pada neurogenesis. Berdasarkan MatrisomeDB, kami mengidentifikasi 127 protein terukur yang dianggap sebagai bagian dari inti ECM dan protein manusia yang terkait dengan ECM (Gambar 3A dan Tabel S3). Di antara ini, kami mengidentifikasi 38 glikoprotein, 15 jenis kolagen, dan 8 proteoglikan, yang semuanya dikategorikan sebagai protein inti matrisom. Selain itu, fibroblas yang dikultur 3D mengekspresikan 16 protein yang berafiliasi dengan ECM, 35 regulator, dan 15 faktor yang disekresikan, yang termasuk dalam kategori protein yang terkait dengan matrisom.
3.4 Analisis Komparatif Matrisom Fibroblast yang Dikultur 3D dengan Studi Proteomik Otak Manusia
Kami selanjutnya berusaha memvalidasi temuan kami dengan membandingkan kumpulan data kami dengan studi yang diterbitkan sebelumnya yang melaporkan analisis proteomik pada jaringan otak manusia [31, 32]. Dalam studi ini, Raghunathan dkk. melaporkan identifikasi total 4395 protein dalam otak postmortem yang diperoleh dari pasien penyakit Parkinson dan individu sehat, sementara Pokhilko dkk. mengidentifikasi jumlah protein yang lebih rendah yaitu 1524 (Gambar 4A). Kami kemudian membandingkan kumpulan data kami, yang terdiri dari 2206 protein terkuantifikasi, dengan data yang diterbitkan sebelumnya dari kedua studi ini, hanya memeriksa ada atau tidaknya protein tanpa membandingkan nilai ekspresi absolut. Khususnya, kami mengidentifikasi 710 protein yang umum dibagi di antara semua kumpulan data (Gambar 4A), dengan kesesuaian sebesar 71,2% antara kumpulan data kami dan data Raghunathan (protein bersama: 1571), sedangkan tumpang tindih dengan data Pokhilko hanya sebesar 33,8% (protein bersama: 746).
3.5 Fibroblas Dermal yang Dikultur dalam 3D Meningkatkan Pembentukan Akson dan Kelangsungan Hidup Neuron secara In Vitro
Untuk memvalidasi prediksi in silico kami, MN yang berasal dari iPSC dimasukkan ke dalam dermis yang direkayasa jaringan seperti yang diilustrasikan (Gambar 5A). Diferensiasi iPSC menjadi MN dewasa divalidasi dengan imunofluoresensi menggunakan penanda spesifik seperti NF-M dan ISLET (Gambar 5B). Pembentukan akson saraf dalam perancah 3D yang dihasilkan oleh fibroblas dermal kemudian dinilai (Gambar 5C). Akson terorganisir dengan baik ketika model dikultur dalam media yang terdiri dari rasio fibroblas dan neuron yang sama, dibandingkan dengan kondisi lain. Dalam kondisi dengan hanya media fibroblas, lebih sedikit neuron yang diamati, sedangkan jaringan akson tampak lebih tidak terorganisir dalam kondisi yang hanya menggunakan media neuron. Meskipun morfologi neuronal tampak dipengaruhi oleh media, tidak ada perbedaan signifikan yang diamati di area yang ditempati oleh MN (Gambar 5D). Uji Hidup-Mati pada MN menunjukkan bahwa paparan media terkondisi yang berasal dari kultur fibroblas dermal 3D, atau campuran 1:1 media terkondisi ini dengan media kultur MN, meningkatkan kelangsungan hidup neuron (Gambar 5E, F). Menariknya, MN hidup yang diamati secara signifikan lebih sedikit ketika sel-sel terpapar secara eksklusif pada media terkondisi fibroblas (Gambar 5G). Oleh karena itu, hasil ini menunjukkan bahwa molekul yang disekresikan oleh fibroblas berkontribusi pada neurogenesis dan kelangsungan hidup neuronal, tetapi tidak cukup untuk mempertahankan kultur MN yang efisien secara in vitro. Lebih jauh, prediksi in silico menunjukkan bahwa sekretom fibroblas kultur 3D kemungkinan akan mengaktifkan proses yang terkait dengan kelangsungan hidup sel, termasuk sel saraf.
4 Pembahasan
Dalam beberapa tahun terakhir, model kompleks yang dihasilkan dari kultur sel 3D telah mendapatkan popularitas dibanding kultur 2D tradisional dan model in vivo [7]. Meskipun ada kemajuan, terdapat kesenjangan yang signifikan dalam ketersediaan model in vitro yang secara akurat mereplikasi kompleksitas dan komposisi ECM otak, yang sangat penting untuk memahami peran ECM dalam proses neurologis. Penelitian saat ini bertujuan untuk mengevaluasi kegunaan fibroblas dermal yang dikultur 3D sebagai perancah ECM yang diproduksi sendiri dan bebas eksogen untuk menyelidiki proses neurobiologis. Temuan kami menunjukkan bahwa fibroblas dermal manusia menunjukkan profil ekspresi protein yang berbeda yang intrinsik pada pendekatan kultur sel 3D yang dipilih. Secara khusus, model rekayasa jaringan 3D memungkinkan fibroblas dermal manusia primer untuk mengeluarkan dan menyusun ECM yang kompleks [33]. Sebenarnya, analisis spektrometri massa menunjukkan pengayaan protein ECM dan protein terkait ECM yang signifikan dalam fibroblas yang dikultur 3D dibandingkan dengan fibroblas yang tumbuh dalam kultur berlapis tunggal. Khususnya, analisis perbandingan mendalam kami mengungkapkan kemiripan yang kuat antara matrisom fibroblas yang dikultur 3D dan otak manusia. Lebih jauh, kami mengidentifikasi beberapa protein ECM dalam kumpulan data kami yang juga sebagian besar diekspresikan di jaringan kulit dan otak manusia, yang menggarisbawahi relevansi potensial model ini. Menariknya, penelitian terkini telah menunjukkan bahwa ECM spesifik jaringan dapat secara signifikan meningkatkan relevansi fisiologis model in vitro [16]. Selain itu, pendekatan ini mempercepat pembentukan dan pematangan jaringan saraf dengan mendorong aktivitas saraf yang disinkronkan lebih awal dan meningkatkan organisasi jaringan.
Kulit dan otak manusia memiliki banyak komponen ECM, termasuk kolagen, fibronektin, laminin, dan proteoglikan [34, 35]. Yang menarik, kami mengidentifikasi protein matrisomal inti dan protein terkait matrisom yang dimiliki oleh dermis fibroblas 3D dan otak manusia, yang diprediksi secara in silico dapat mendorong neurogenesis. Oleh karena itu, proses terkait neurogenesis, seperti sinaptogenesis, aksonogenesis, mielinisasi, dan kelangsungan hidup neuron, juga diprediksi akan diaktifkan dalam model kami. Hal ini menunjukkan bahwa protein yang diekspresikan oleh fibroblas dermal 3D menciptakan lingkungan mikro proneurogenik yang memungkinkan kultur sel neuron dan pembentukan jaringan neuron fungsional. Di antara protein neurogenik yang diidentifikasi dalam dermis 3D, beberapa protein matrisomal diekspresikan secara berbeda, banyak di antaranya juga ditemukan di otak manusia. Protein-protein ini diketahui memainkan peran penting dalam pengembangan dan perbaikan sistem saraf, dan dalam menjaga fungsi saraf selama cedera atau penyakit [11]. Meskipun beberapa protein menunjukkan ekspresi diferensial yang signifikan, kontribusi protein-protein ini terhadap neurogenesis kemungkinan besar muncul dari pengaruh kolektif jaringan protein ECM yang lebih luas daripada efek terisolasi dari masing-masing komponen. Hal ini menggarisbawahi pentingnya mempertimbangkan interaksi holistik dalam ECM saat mempelajari proses neurogenik. Interaksi semacam itu khususnya relevan dalam konteks otak, di mana ECM membentuk jaringan protein dan molekul lain yang kompleks dan dinamis yang menyediakan dukungan struktural, mengatur perilaku sel, dan memengaruhi perkembangan dan fungsi saraf [10]. ECM bertindak sebagai perancah untuk sel induk saraf, memfasilitasi aktivasi dan proliferasi sel-sel ini melalui isyarat mekanis dan pengiriman faktor pertumbuhan penting dan molekul pensinyalan [36]. Selain itu, ECM memainkan peran penting dalam pembentukan dan stabilisasi sinapsis antara neuron yang baru terbentuk dan targetnya, yang mendorong pembentukan koneksi fungsional dalam ceruk neurogenik [37]. Berdasarkan pemahaman ini, penelitian terkini menyoroti peran penting komponen ECM di otak dan jaringan lain, seperti kulit, di mana fibroblas berfungsi sebagai kontributor utama untuk produksi dan organisasi ECM [16, 38]. Meskipun ECM otak memiliki komposisi yang unik, diperkaya dengan proteoglikan unik seperti brevican, neurocan, dan tenascin-R, penelitian telah menunjukkan bahwa ECM yang berasal dari fibroblas dapat meniru beberapa aspek fungsional ECM otak serta mereplikasi fitur patologis yang sudah ada saat membudidayakan fibroblas yang berasal dari pasien menjadi ECM yang diproduksi sendiri [17-19]. Pekerjaan sebelumnya oleh Lam et al. menunjukkan penggabungan substrat ECM ke dalam kultur neuron mempercepat pembentukan dan pematangan jaringan [16]. Memang, ECM spesifik jaringan telah terbukti penting dalam meningkatkan kesehatan dan fungsionalitas neuron, terutama dalam kultur jangka panjang. Misalnya, MaxGel, koktail ECM manusia yang tersedia secara komersial yang berasal dari kultur sel kulit, telah terbukti mendukung kultur neuron seefektif ECM spesifik otak [16].
Membudidayakan neuron dalam 3D menggunakan metode standar tetap menjadi tantangan yang signifikan, sering kali padat karya, memakan waktu, dan sulit untuk dioptimalkan. Temuan kami menunjukkan bahwa dermis yang direkonstruksi dari fibroblas yang dikultur 3D tidak hanya memproses ECM yang sebanding dengan SSP tetapi juga menciptakan lingkungan proneurogenik yang mendukung kultur neuronal dan pembentukan akson. Bukti yang muncul menunjukkan peran penting fibroblas SSP dalam mendukung fungsi utama sel progenitor neuronal, termasuk proliferasi dan migrasi [38]. Selain itu, hubungan antara fibroblas dan otak semakin diakui, terutama dalam komunikasi jaringan melalui jalur pensinyalan, interaksi neuroimun, dan sekresi parakrin molekul neurotropik [39]. Berdasarkan temuan ini, penelitian kami mengungkapkan bahwa MN yang berasal dari iPSC dapat berhasil dikultur bersama dengan fibroblas kulit, memungkinkan kelangsungan hidup selama periode kultur yang diperpanjang. Sistem kokultur ini menawarkan platform yang kuat untuk menyelidiki penyakit neurodegeneratif secara in vitro, menggabungkan relevansi fisiologis dengan skalabilitas praktis, dan memiliki potensi besar untuk memajukan pengobatan yang dipersonalisasi dengan memungkinkan studi khusus pasien dan strategi terapi yang disesuaikan. Keuntungan utama dari pendekatan ini terletak pada ECM yang disekresikan sendiri yang berasal dari fibroblas, yang sebagian mereplikasi lingkungan mikro SSP. ECM ini menyediakan matriks pendukung untuk kultur neuronal tanpa memerlukan suplementasi media dengan aditif eksogen yang mahal, menjadikan ECM sangat menguntungkan untuk ilmu saraf dan penelitian sel punca. Hasil kami menunjukkan bahwa ECM yang berasal dari fibroblas dan faktor yang disekresikan dalam media terkondisi meningkatkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup neuronal, menciptakan lingkungan proneurogenik. Namun, komponen-komponen ini saja tidak cukup untuk mempertahankan jaringan saraf dari waktu ke waktu. Neuron juga cenderung berkontribusi pada lingkungan ini dengan mengeluarkan protein ECM mereka sendiri, yang dapat meningkatkan aktivitas saraf secara in vitro dan mengimbangi komponen ECM yang tidak dapat diproduksi oleh fibroblas dermal [40]. Interaksi antara sel ECM yang berasal dari fibroblas dan yang disekresikan neuron ini menyoroti sifat dinamis sistem ini dan menggarisbawahi potensi sistem ini sebagai platform yang serbaguna dan relevan secara fisiologis untuk mempelajari proses neurobiologis dan pengembangan terapi.
Setiap model 3D memiliki kekuatan dan keterbatasan yang unik, dengan pilihan yang bergantung pada pertanyaan penelitian tertentu. Dalam sistem saraf, sel ECM sangat dinamis, mendukung proses seperti perkembangan saraf, plastisitas sinaptik, kelangsungan hidup neuron, dan perbaikan cedera [40]. Disregulasi pergantian sel ECM, yang melibatkan sintesis dan proteolisis berkelanjutan, dapat berkontribusi pada perkembangan penyakit [12, 14]. Menangkap dinamika sel ECM yang cepat ini merupakan tantangan dalam model hewan, yang memberikan sistem rekayasa jaringan keuntungan tersendiri untuk mempelajari gangguan terkait sel ECM.
Model kami menawarkan beberapa keuntungan utama dibandingkan sistem 3D lainnya. Sel ECM yang berasal dari fibroblas dermal sangat mirip dengan lingkungan ekstraseluler alami, menyediakan matriks protein dan molekul sinyal yang kaya yang mendukung neurogenesis dan kelangsungan hidup neuron. Selain itu, sistem kultur 3D yang dijelaskan mereplikasi kompleksitas struktural lingkungan in vivo sambil mempertahankan kesederhanaan, reproduktifitas, dan kontrol. Fibroblas dermal adalah sel perifer yang mudah diakses yang dapat diperoleh secara noninvasif dari pasien, diprogram ulang secara efisien menjadi sel saraf, dan dapat disimpan secara biologis, menjadikannya model yang dapat diskalakan, hemat biaya, dan praktis untuk berbagai aplikasi [41]. Terakhir, model ini sangat dapat disesuaikan, memungkinkan integrasi dengan jenis sel lain untuk mempelajari interaksi sel-ECM dalam berbagai kondisi. Fitur-fitur ini memposisikan model kami sebagai alat yang serbaguna dan efisien untuk mengeksplorasi neurobiologi, mekanisme dan jalur khusus ECM, dan interaksi reseptor-ligan. Meskipun model kami menawarkan keunggulan dibandingkan yang lain, kami mengakui bahwa faktor-faktor di luar sekresi fibroblas, seperti komponen serum, juga dapat berkontribusi pada efek yang diamati. Berdasarkan kekuatan model rekayasa jaringan, munculnya teknik penyaringan throughput tinggi dan alat analisis canggih di era “omics”, seperti spektrometri massa kuantitatif, telah lebih jauh mengubah studi dinamika biomolekuler yang kompleks. Inovasi-inovasi ini semakin banyak diterapkan pada penelitian penyakit neurologis, yang memungkinkan penyelidikan kompleksitas molekuler dan mekanisme patogenik yang mendasarinya yang masih kurang dipahami [42]. Memang, spektrometri massa telah memberikan wawasan yang belum pernah ada sebelumnya ke dalam profil ekspresi protein spesifik dari berbagai wilayah otak manusia. Mengintegrasikan kumpulan data proteomik ini dengan basis data sumber terbuka yang berasal dari studi in vitro baru, termasuk sistem yang dipersonalisasi menggunakan fibroblas yang berasal dari pasien, merupakan langkah selanjutnya dalam memajukan pemahaman tentang penyakit saraf.
5 Kesimpulan
Memperoleh pemahaman yang komprehensif tentang interaksi rumit antara sel-sel ECM dan sel-sel saraf akan sangat penting untuk menjelaskan mekanisme yang mendasari yang terlibat dalam penyakit neurologis dan untuk mengembangkan terapi. Hal ini menyoroti pentingnya mempertahankan kompleksitas molekuler asli ECM, karena memainkan peran penting dalam mengatur pertumbuhan neuronal, neurogenesis, dan kelangsungan hidup. Meskipun model kami menggunakan ECM yang berasal dari fibroblas dermal, model ini menunjukkan kapasitas yang sebanding untuk menyediakan lingkungan mikro yang kaya akan ECM yang mendukung neurogenesis. Kesamaan molekuler yang substansial antara matrisom fibroblas kultur 3D kami dan ECM otak semakin mendukung kegunaan model ini untuk mempelajari proses SSP.
Temuan-temuan ini secara kolektif menekankan nilai model berbasis fibroblas dermal 3D sebagai alternatif yang dapat diskalakan, hemat biaya, dan relevan secara fisiologis untuk menyelidiki penyakit neurologis. Meskipun hasil kami menunjukkan bahwa ECM yang berasal dari fibroblas menyediakan lingkungan mikro yang diperkaya untuk neurogenesis, penelitian di masa mendatang dapat mengeksplorasi pengintegrasian ECM spesifik jaringan atau peningkatan ECM yang berasal dari fibroblas untuk lebih meningkatkan tiruannya terhadap karakteristik spesifik SSP. Upaya ini akan memajukan pengembangan model yang lebih baik yang menjembatani kesenjangan antara penelitian in vitro dan kompleksitas in vivo. Dalam hal ini, membudidayakan fibroblas dermal yang berasal dari pasien dalam kultur 3D dapat menawarkan alternatif yang berharga dan kurang invasif untuk biopsi otak, menyediakan model yang dipersonalisasi secara in vitro untuk mempelajari gangguan neurologis yang kompleks.
Leave a Reply