ABSTRAK
Biofarmaka adalah senyawa medis yang berasal dari sumber biologis dan sering kali diproduksi oleh sel hidup, terutama sel ovarium hamster Cina (CHO). Sel CHO menunjukkan variasi di antara klon sel, yang menyebabkan perbedaan pertumbuhan dan produktivitas yang memengaruhi kuantitas dan kualitas produk. Faktor biologis dan lingkungan di balik perbedaan ini belum sepenuhnya dipahami. Untuk mengidentifikasi metabolit dengan hubungan yang konsisten dengan produktivitas atau kematian sel dari waktu ke waktu, kami menganalisis metabolom ekstraseluler dari 11 klon CHO dengan karakteristik pertumbuhan dan produktivitas yang berbeda selama 14 hari. Namun, dalam proses bioreaktor, profil metabolik dan variabel proses keduanya sangat bergantung pada waktu, sehingga membingungkan hubungan variabel metabolit-proses. Untuk mengatasi hal ini, kami menyesuaikan pendekatan hierarkis yang ada untuk menangani ketergantungan waktu guna menyoroti metabolit dengan korelasi yang konsisten dengan variabel proses selama jangka waktu tertentu. Kami membandingkan metode baru ini dengan model kuadrat parsial ortogonal (OPLS) konvensional. Metode hierarkis kami menyoroti beberapa metabolit yang secara konsisten terkait dengan produktivitas atau kematian sel yang terlewatkan oleh metode konvensional. Metabolit ini relevan secara biologis; sebagian besar sudah diketahui, tetapi beberapa yang belum pernah dilaporkan dalam literatur CHO sebelumnya, seperti 3-metoksitirosin dan suksiniladenosin, memiliki hubungan dengan kematian sel dalam penelitian dengan jenis sel lain. Metabolit menunjukkan hubungan terbalik dengan variabel respons: yang berkorelasi positif dengan produktivitas biasanya berkorelasi negatif dengan tingkat kematian, atau sebaliknya. Untuk produktivitas dan kematian sel, siklus sitrat dan jalur yang berdekatan (piruvat, glioksilat, pantotenat) adalah yang paling penting. Singkatnya, kami telah mengusulkan metode baru untuk menganalisis data omik yang bergantung waktu dalam produksi bioproses. Pendekatan ini memungkinkan kami untuk mengidentifikasi metabolit yang terkait dengan kematian sel dan produktivitas yang tidak terdeteksi dengan model tradisional.
1 Pendahuluan
Biofarmaka, atau biologika, adalah obat-obatan yang berasal dari sumber biologis. Biofarmasi meliputi vaksin, antibodi monoklonal (mAb), dan protein rekombinan lainnya. Sel mamalia merupakan sistem ekspresi terdepan dalam industri biologika [1], yang mencakup 2/3 dari obat-obatan yang baru disetujui dari tahun 2018 hingga 2022, di mana sel ovarium hamster Tiongkok (CHO) mencakup 89% [2]. Sel CHO merupakan sistem produksi yang baik, mencapai kepadatan tinggi dalam media yang ditentukan secara kimiawi dan kultur suspensi [3]. Sel CHO juga dapat membuat modifikasi pascatranslasi yang kompatibel dengan manusia seperti pelipatan protein dan glikosilasi [1] dan kurang rentan terhadap virus manusia dibandingkan sel lainnya [3].
Meningkatnya permintaan akan biologika memerlukan produksi yang lebih tinggi. Saat ini, titer protein sekitar 10 g/L dimungkinkan dalam kultur fed-batch yang berlaku [4]. Namun, kultur berkelanjutan muncul karena kemajuan dalam bioproses hulu. Kultur berkelanjutan mendaur ulang limbah dengan sistem pemberian perfusi, meningkatkan waktu reaktor idle dan kepadatan sel yang hidup (VCD), yang pada gilirannya meningkatkan produktivitas volumetrik (g/L/hari). Produktivitas juga dapat ditingkatkan pada tingkat spesifik sel (qP) melalui rekayasa lini sel atau kondisi kultur yang dioptimalkan [5]. Dua puluh juta sel/mL dan 50 pg/sel/hari [6] telah dicapai dalam kultur fed-batch. Namun, VCD tidak dapat meningkat tanpa batas, dan VCD yang lebih tinggi mungkin tidak menghasilkan titer yang lebih tinggi jika qP terpengaruh secara negatif [4]. Dengan demikian, mengoptimalkan tidak hanya VCD tetapi juga qP sangat penting untuk meningkatkan produktivitas volumetrik lebih lanjut.
Proliferasi sel diatur oleh dua proses yang saling melengkapi: pembelahan sel, diukur dengan laju pertumbuhan spesifik (µg, 1/hari), dan kematian sel, diukur dengan laju kematian spesifik (µd, 1/hari) [7]. Laju ini menginformasikan bagaimana VCD berevolusi: meningkat dalam fase eksponensial (µg > µd), memuncak pada fase stasioner (µg ≈ µd), dan menurun pada fase kematian (µg < µd) [8]. Sebagian besar studi CHO menargetkan fase eksponensial dan stasioner. Lebih sedikit yang meneliti fase kematian [9], yang menunjukkan perlunya mempelajari metabolisme CHO lebih lanjut di akhir produksi. Kematian sel merugikan kualitas dan titer produk. Sel yang sekarat melepaskan enzim yang mendegradasi protein rekombinan dan mengubah struktur glikana. Puing-puing seluler juga menciptakan kotoran, yang mempersulit bioproses hilir [10]. µd meningkat seiring waktu, berakselerasi dari fase stasioner, kemungkinan karena produk sampingan yang beracun, bukan kehabisan nutrisi [4]. Menghilangkan metabolit limbah melalui perfusi dapat meningkatkan viabilitas dan produktivitas. Laktat dan amonia, metabolit limbah utama dari glukosa dan asam amino, masing-masing, dapat dibatasi dengan strategi pemberian pakan yang dioptimalkan [9], tetapi metabolit toksik lainnya juga harus dipertimbangkan untuk meningkatkan produktivitas kultur [3, 9, 11]. Teknik omik multidimensi membantu dalam menyelidiki sistem biologis. Metabolomik, khususnya, menghubungkan cuplikan fisiologi seluler dengan fenotipe penting seperti produktivitas tinggi atau kematian sel rendah [3, 12]. Teknik kemometrik membantu menginterpretasikan data metabolomik. Analisis komponen utama (PCA) mengidentifikasi tren dan outlier secara keseluruhan, sementara kuadrat parsial ortogonal (OPLS) menghubungkan metabolit dengan variabel proses, atau membedakan antara kelas sampel [13]. Teknik-teknik ini telah diterapkan pada fase pertumbuhan metabolisme CHO [14], kepadatan sel [15], dan komposisi media [16], mengidentifikasi target untuk pengembangan lini sel dan media, seperti metabolit yang menghambat pertumbuhan atau menginduksi apoptosis [4, 17, 18]. Bahkan dalam kondisi pertumbuhan yang identik, sel CHO menunjukkan variasi klonal, yang menyebabkan perbedaan pertumbuhan dan produktivitas antara kelompok produksi yang memengaruhi titer dan atribut kualitas kritis [12]. Namun, biologi yang mendasarinya belum dieksplorasi. Kendala di sini adalah waktu. Sampel metabolomik dari kelompok yang sama tidak independen dari waktu ke waktu, sehingga menciptakan korelasi variabel metabolit-proses yang tinggi secara artifisial. PCA mengalami kesulitan ketika variasi terbesar terkait dengan waktu [19]. Berbagai teknik berbasis (O)PLS telah digunakan dengan deret waktu, masing-masing dengan kekuatan dan kekurangannya: PLS pada model tingkat kelompok dapat memberikan korelasi metabolik per titik waktu [20], tetapi variabel respons monotonik atau kumulatif tentu saja bergantung pada waktu [21]. Analisis diskriminan (DA) OPLS dapat membandingkan titik waktu secara berpasangan [14], tetapi perbedaannya mungkin tidak terkait dengan variabel proses yang diinginkan. PLS-DA multiarah [22] dapat membandingkan kelompok lini sel untuk satu titik waktu atau keseluruhan, tetapi mungkin tidak menangkap perubahan dalam variabel respons dari waktu ke waktu. Untuk mengatasi ketergantungan waktu, dalam penelitian ini, kami merancang metode hierarkis berdasarkan regresi OPLS untuk menganalisis metabolit pada setiap titik waktu secara terpisah. Kami membandingkan metode kami dengan model OPLS global konvensional yang mempertimbangkan metabolit pada semua titik waktu secara bersamaan. Untuk mencari metabolit yang terkait dengan produktivitas dan kematian sel, kami menganalisis metabolom ekstraseluler sel CHO dengan berbagai sifat pertumbuhan dan produktivitas. Metode baru ini mengidentifikasi beberapa metabolit dengan hubungan yang konsisten dengan qP dan/atau µd dalam fase stasioner dan kematian yang terlewatkan oleh metode global. Banyak metabolit yang secara biologis relevan dengan kematian dan/atau produktivitas sel CHO, yang menunjukkan keefektifan metode baru dalam menganalisis data omik bioproses yang bergantung pada waktu.
2 Bahan dan Metode
2.1 Lini Sel dan Kondisi Kultur
Kami menumbuhkan sebelas klon dari lini sel induk CHO-DG44 yang sama (Sartorius, Jerman) sebagai kultur fed-batch dalam bioreaktor Ambr 250 High Throughput paralel otomatis 0,25 L (Sartorius, Jerman) seperti yang dijelaskan sebelumnya [23]. Setiap klon memiliki sifat pertumbuhan dan produktivitas yang berbeda, tetapi semuanya mengekspresikan IgG1 mAb yang sama. Reaktor beroperasi selama 14 hari (satu reaktor dihentikan pada hari ke-12 setelah kontaminasi). Sampel diambil secara otomatis setiap hari oleh penangan cairan Ambr 250 (Sartorius, Jerman).
2.2 Analisis Metabolomik Ekstraseluler
Kami melakukan analisis metabolomik metabolit ekstraseluler tanpa target menggunakan kromatografi gas dan cair tandem-spektrometri massa (LC-MS/MS, GC-MS), dan spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR). Informasi Pendukung merinci persiapan sampel, kuantisasi, dan pra-pemrosesan data. Kami menghilangkan metabolit dengan deviasi standar relatif lebih dari 30% dalam sampel kontrol kualitas, rasio sinyal terhadap derau di bawah 3, dan duplikat di seluruh LC, GC, dan/atau NMR. Secara keseluruhan, 109 metabolit unik diberi anotasi.
2.3 Variabel Bioproses Variabel
kultur sel (Gambar S1) diukur dengan BioProfile FLEX2 (Nova Biomedical, AS), seperti halnya titer menggunakan sistem Octet R8 (Sartorius, Jerman). Setelah menghilangkan outlier, kami menghitung dua variabel proses: tingkat kematian spesifik (µd, 1/hari) dan produktivitas spesifik (qP, pg/sel/hari). Untuk qP, data titer dihaluskan menggunakan fungsi logistik generik, dan turunannya dinormalisasi ke VCD. µd dan laju pertumbuhan spesifik (µg, 1/hari) dihitung seperti yang dijelaskan sebelumnya [24]. Kami menetapkan fase pertumbuhan sel sebagai berikut: eksponensial: µg > µd (≈ hari 1–6); stasioner: µg ≈ µd (≈ hari 7–8); kematian: µg < µd, (≈ hari 9–14).
2.4 Analisis Data Multivariat (MVDA)
Kami melakukan MVDA menggunakan SIMCA, versi 18.0.0 (Sartorius, Swedia). Semua data berpusat pada rata-rata dan diskalakan ke varians unit (UV) kecuali dinyatakan lain. PCA memberikan gambaran umum data dan deteksi outlier. Regresi OPLS menghubungkan kadar metabolit relatif (X) ke µd atau qP sebagai variabel respons (y). SIMCA secara otomatis memperkirakan jumlah komponen model dari koefisien prediksi (Q2) menggunakan validasi silang. Model yang melebihi dua komponen dikurangi secara manual menjadi 1 prediktif + 1 ortogonal untuk menghindari risiko overfitting [25]. Untuk menemukan kerangka waktu di mana konsentrasi metabolit berkorelasi dengan respons (µd atau qP), kami membuat satu model per hari dan respons, menghasilkan 14 model OPLS µd dan 14 qP. Mirip dengan penelitian lain [26], kami menggunakan Q2 > 0,25 sebagai ambang batas untuk model yang dapat diterima, hanya mempertahankan hari-hari yang berdekatan untuk kohesi, yang berarti hari ke-8–14 untuk qP dan 7–14 untuk µd, yang mencakup fase stasioner dan kematian. Kami menilai hubungan metabolit dengan variabel bioproses dengan dua metode. Dalam metode global, kami membuat model OPLS tunggal untuk setiap respons (µd atau qP) menggunakan sampel dari hari-hari yang dipertahankan. Dalam metode hierarkis, kami menggunakan model OPLS yang dipertahankan 8 µd dan 7 qP dan menghitung pemuatan skala korelasi metabolit (p(corr)) [21]. Nilai p(corr) kemudian digunakan sebagai input dalam model proyeksi efek OPLS (EP) [27] tanpa pemusatan rata-rata. OPLS-EP menggunakan p(corr) sebagai data X terhadap vektor kolom y = 1 untuk mengidentifikasi tren umum antara titik waktu. Kami membandingkan metabolit mana yang disorot sebagai signifikan dalam metode global dan hierarkis. Signifikansi diperkirakan menggunakan nilai p(corr) dari dua model OPLS global dan dua model OPLS-EP. p(corr) secara fungsional setara dengan koefisien korelasi Pearson (PCC atau Mr) [28] dengan signifikansi berdasarkan distribusi t dua sisi Student:
di mana t adalah statistik-t dan n adalah jumlah sampel independen. Metode global menetapkan jumlah kelompok sebagai n karena sampel dari hari yang berbeda saling bergantung. Jika n adalah jumlah sampel, hampir semua metabolit akan signifikan. Metode hierarkis menetapkan jumlah hari sebagai n karena semua kelompok dipadatkan menjadi satu nilai [21]. p(corr) metode global menggambarkan korelasi metabolit-respons, sedangkan p(corr) metode hierarkis menggambarkan korelasi berukuran konsisten antara titik waktu. Untuk menghindari penandaan keliru metabolit yang konsisten tetapi berkorelasi diabaikan sebagai signifikan, kami menetapkan ambang batas p(corr) rata-rata menjadi 0,30 [29] (Gambar S2). Informasi Pendukung berisi analisis kelebihan representasi jalur dari metabolit yang signifikan.
3 Hasil dan Pembahasan
3.1 Pembandingan Pemodelan Hirarkis dengan OPLS-EP terhadap Pemodelan OPLS Global
Metode yang kami sajikan di sini bertumpu pada pendekatan hierarkis untuk memodelkan data bioproses oleh Alinaghi et al. [21]. Pendekatan mereka menangkap hubungan antara metabolit dan variabel respons dengan model regresi OPLS terpisah untuk setiap titik waktu, kemudian menggunakan nilai p(corr) metabolit, yang meringkas setiap kelompok menjadi satu nilai per titik waktu, memvisualisasikannya dalam model PCA [21]. Akan tetapi, model PCA menunjukkan perbedaan secara keseluruhan, seperti korelasi metabolik mana yang berubah seiring waktu. Dalam studi ini, kami berfokus pada kesamaan: metabolit dengan hubungan yang konsisten dan kuat terhadap respons pada setiap titik waktu. Jadi, kami mengganti model PCA dengan model OPLS-EP (Gambar 1). OPLS-EP [27] awalnya dikembangkan untuk sampel dependen di mana variasi dalam kelompok dapat melebihi variasi antarkelompok. OPLS-EP menangkap perbedaan Xafter—Xbefore sebagai Xeffect terhadap vektor kolom y = 1, yang menyorot variabel yang berubah dalam arah yang sama untuk sebagian besar pengamatan [27]. Di sini, kami menggunakan p(corr) sebagai pengganti Xeffect, yang mengungkap metabolit yang berkorelasi secara konsisten dengan variabel respons di sebagian besar hari tanpa ketergantungan waktu.
3.2 Metabolit yang Berkorelasi Signifikan dengan qP dan µd Diperkaya dalam Jalur yang Mirip
Setelah membandingkan metode, kami mengeksplorasi apakah kumpulan metabolit berkorelasi signifikan dari model hierarkis tertentu diperkaya dalam jalur tertentu relatif terhadap semua senyawa yang diketahui dalam jalur terkait CHO selama hari ke 7–14 (µd, Gambar S3A) dan 8–14 (qP, Gambar S3B). Tabel S1 mencantumkan jalur per metabolit. Karena sebagian besar metabolit berkorelasi dengan kedua respons, profil pengayaannya tumpang tindih, yang menunjukkan bahwa banyak jalur terkait dengan kedua respons:
Kedua respons: transporter kaset pengikat ATP (ABC); siklus asam trikarboksilat (TCA); biosintesis pantotenat dan koenzim A (CoA); metabolisme beta-alanin; metabolisme alanin, aspartat, dan glutamat; metabolisme glioksilat dan dikarboksilat; metabolisme glisin, serin, dan treonin; dan metabolisme glutathione.
Khusus untuk µd: ferroptosis (kematian sel akibat akumulasi zat besi dan lipid peroksida).
Khusus untuk qP: biosintesis aminoasil-tRNA, metabolisme gliserofosfolipid, metabolisme asam amino D, dan metabolisme piruvat.
Dalam penelitian sebelumnya, siklus TCA diperkaya untuk qP [4]. Metabolisme pantotenat dan CoA terlihat jelas dalam fase stasioner, seperti halnya metabolisme piruvat, glioksilat, dan dikarboksilat dalam fase kematian [14]. Metabolisme gliserofosfolipid telah dikaitkan dengan keterbatasan pertumbuhan [18]. Metabolisme glutathione terkait dengan respons stres oksidatif [31] dan produktivitas [32]. Sementara transporter ABC dan biosintesis aminoasil-tRNA signifikan, keduanya tidak spesifik dan dapat mencerminkan asam amino individual mana pun.
Kami mengeksplorasi korelasi respons-asam amino lebih lanjut. Banyak asam amino yang hadir dalam pakan dan/atau medium (Tabel S1), yang memengaruhi kadarnya dari waktu ke waktu dan membatasi bagaimana mereka mencerminkan perubahan metabolisme CHO. Sebagian besar asam amino dideteksi oleh NMR, yang memiliki tiga sampel harian, tetapi kami hanya membuat model dengan satu untuk bekerja dengan data LC/GC-MS. Data NMR menunjukkan bahwa setiap bolus meningkatkan kadar asam amino (Gambar 4A) lebih banyak daripada yang dikonsumsi sel di antara waktu pemberian pakan, untuk peningkatan bersih dari waktu ke waktu, memberikan korelasi palsu. Hanya glutamin (Gambar 4B) yang tidak menunjukkan perilaku ini, mungkin karena penipisannya di awal [33]. Meskipun di luar cakupan studi ini, mempelajari tingkat produksi dan konsumsi alih-alih konsentrasi mungkin lebih baik mengkarakterisasi bagaimana asam amino memengaruhi produktivitas dan kematian sel. Untuk saat ini, kami menyarankan pengguna memantau metabolit pakan secara online atau mengambil beberapa sampel per interval pemberian pakan dalam kultur fed-batch dan kontinyu untuk memastikan bahwa perubahan konsentrasi yang diamati berasal dari metabolisme seluler, bukan pemberian pakan.
3.3 Metabolit yang Unik untuk Pemodelan Hirarkis Relevan Secara Biologis
Analisis jalur mencakup semua metabolit signifikan dari metode hierarkis, tetapi beberapa juga signifikan dalam metode global. Tidak termasuk asam amino, 28 metabolit unik untuk metode hierarkis (Tabel 1). Selanjutnya, kami memeriksa relevansi biologisnya terhadap respons.
Metabolisme karbohidrat sangat penting untuk pertumbuhan dan produktivitas sel. Sel CHO lebih suka mengubah glukosa menjadi laktat melalui glikolisis aerobik, bahkan dengan oksigen yang cukup. Laktat mengurangi pertumbuhan dan produktivitas sel dan dapat menginduksi apoptosis [33]. Kami menemukan bahwa laktat berkorelasi secara signifikan dengan qP. Jika glukosa habis, sel CHO mengonsumsi laktat sebagai gantinya [33], mengubah laktat menjadi piruvat dan asetil-KoA. Asetil-KoA dapat dibuat menjadi asetat, yang kami amati berkorelasi secara signifikan dengan µd dan berkorelasi secara signifikan dengan qP, yang terkumpul secara ekstraseluler dalam fase stasioner. Namun, asetil-KoA terutama memasuki siklus TCA dan fosforilasi oksidatif, yang sangat aktif dalam sel CHO yang produktif [33]. Zat antara TCA dapat keluar ke sitosol [34], jadi pengisian ulang zat antara tersebut mendukung aktivitas siklus TCA.
Kami mendeteksi beberapa zat antara TCA. Cis- dan trans-akonitat serta sitrat/isositrat (tidak dapat dibedakan) berkorelasi signifikan dengan qP dan berkorelasi anti dengan µd. Dalam satu penelitian, suplementasi dengan suksinat, malat, dan α-ketoglutarat meningkatkan qP hingga 35% tanpa kehilangan viabilitas [35]. Penambahan suksinat menghasilkan pertumbuhan positif ke fase stasioner dan qP tertinggi di antara semua zat antara yang diuji [34]. Sitrat, cis-akonitat, fumarat, malat, dan suksinat berkorelasi dengan qP dan berkorelasi anti dengan VCD dalam fase stasioner. Penambahan sitrat dalam fase eksponensial mengurangi puncak VCD tetapi meningkatkan qP [4]. Sitrat dalam pakan menurunkan VCD lebih awal daripada pada kontrol, mungkin karena apoptosis [34].
Zat antara TCA diisi ulang menggunakan asam amino dari medium dan biosintesis seluler [36], pertama dengan glutamin, kemudian asam amino lainnya [33]. Asam amino yang berlebihan atau dikatabolisme dapat menciptakan turunan penghambat pertumbuhan yang dapat terakumulasi di luar sel [3]. Amonia, produk sampingan utama, berdampak negatif pada produktivitas dan pertumbuhan sel [37]. Turunan lainnya termasuk 4-hidroksifenilaktat, penghambat pertumbuhan yang berasal dari fenilalanina dan triptofan [38], yang kami temukan berkorelasi signifikan dengan µd dan berkorelasi anti dengan qP. N-formilmetionina, produk sisteina dan metionina, terakumulasi dalam fase eksponensial dan stasioner [18]. Di sini, N-formilmetionina menurun pada fase kematian, berkorelasi signifikan dengan qP dan berkorelasi anti dengan µd. Format, produk dari serina, glisin, dan treonina, berdampak negatif pada pertumbuhan [38]. Dalam penelitian kami, format berkorelasi signifikan dengan qP dan berkorelasi anti dengan µd. Produksi asam lemak mengikuti laju permintaan seluler selama pertumbuhan tetapi tetap aktif bahkan selama tidak tumbuh, yang menyebabkan penumpukan dari waktu ke waktu [18]. Gliserol-3-fosfokolin dan fosfokolin menurun di dalam sel dan terakumulasi di luar pada fase eksponensial, berkorelasi dengan apoptosis [17, 37]. Dalam penelitian kami, gliserol-3-fosfokolin berkorelasi signifikan dengan µd. Gliserol-3-fosfokolin dan fosfokolin berkorelasi negatif dengan qP dan terakumulasi pada fase kematian. Penumpukan fosfolipid dapat mengindikasikan kontrol metabolisme lipid dan komposisi membran yang buruk [3]. Sebaliknya, prekursor membran plasma intraseluler menurun dari waktu ke waktu [18], sehingga metabolisme lipid dan keterbatasan pertumbuhan sel saling terkait erat.
Produksi energi sangat penting dalam sintesis mAb karena sel membutuhkan ATP untuk membentuk ikatan peptida [39]. Produsen mAb yang tinggi memiliki kadar pembawa elektron yang lebih tinggi dalam fosforilasi oksidatif [31]. Namun, proses ini menciptakan spesies oksigen reaktif, yang dapat didetoksifikasi oleh glutathione tereduksi (GSH) melalui oksidasi GSH menjadi GSSG. Sintesis GSH diatur naik dalam sel CHO produktif [32], sementara GSSG berkorelasi dengan aktivitas caspase dan dapat menginduksi apoptosis dalam kultur segar [31]. Anehnya, penipisan GSH menyebabkan berkurangnya sintesis kolesterol. Karena sintesis kolesterol tinggi meningkatkan produktivitas dengan meningkatkan kapasitas sekresi, efek produktivitas GSH mungkin terkait dengan kolesterol [40]. Dalam penelitian kami, kolesterol berkorelasi signifikan dengan µd dan berkorelasi anti dengan qP.
Sejauh pengetahuan kami, beberapa metabolit yang secara eksklusif signifikan dalam model hierarkis belum pernah dikaitkan dengan produktivitas atau kematian sel dalam sel CHO sebelumnya, sehingga menarik untuk penelitian di masa mendatang. Namun, beberapa metabolit memiliki hubungan dalam lini sel lain. Misalnya, 3-metoksitirosin berkorelasi signifikan dengan qP, berkorelasi anti dengan µd, dan terakumulasi dalam fase kematian. Pada manusia, kadar 3-metoksitirosin patogenik dapat menyebabkan stres oksidatif dan kemungkinan kematian sel [41]. γ-glutamiltriptofan menghambat pertumbuhan sel dalam lini sel tumor [42]. Dalam penelitian kami, γ-glutamiltriptofan berkorelasi signifikan dengan qP dan berkorelasi anti dengan µd dalam fase kematian. Suksiniladenosin berkorelasi signifikan dengan µd, berkorelasi anti dengan qP, dan terakumulasi dari waktu ke waktu dalam penelitian kami. Dalam adiposit, suksiniladenosin diperkaya secara signifikan setelah apoptosis [43]. Singkatnya, sebagian besar metabolit yang hanya disorot oleh metode hierarkis relevan secara biologis dengan produktivitas dan/atau kematian sel dalam sel CHO. Beberapa metabolit yang berkorelasi, sejauh pengetahuan kami, belum pernah dilaporkan dalam sel CHO sebelumnya. Sementara beberapa metabolit telah diketahui dari penelitian lain, metabolit tersebut sering kali berkaitan dengan fase eksponensial atau stasioner, dan produktivitas atau kematian sel. Kami melaporkan korelasi untuk fase kematian dan kedua respons untuk sebagian besar metabolit. Meskipun kami memiliki kadar metabolit untuk seluruh kelompok (14 hari), kami hanya memperoleh model kelas fungsional dalam fase stasioner dan kematian. Hal ini mungkin berasal dari waktu yang tidak cukup bagi sel untuk memengaruhi media ekstraseluler dalam fase eksponensial [21]. Atau, µd dan qP mungkin tidak relevan pada awalnya; misalnya, µd tetap rendah selama fase eksponensial.
4 Kesimpulan
Data deret waktu bioproses sulit dianalisis. Baik profil metabolik maupun variabel proses bergantung pada waktu, sehingga membingungkan bagaimana metabolit berhubungan dengan variabel proses. Metode statistik berbasis korelasi tradisional tidak dapat mengatasi ketergantungan waktu ini. Di sini, kami mengadopsi metode hierarkis baru untuk memodelkan data yang bergantung pada waktu di setiap titik waktu secara terpisah berdasarkan p(corr), menggabungkan hasil dalam model OPLS-EP. Kami menerapkan metode ini pada metabolom ekstraseluler dari 11 klon CHO dengan sifat pertumbuhan dan produktivitas yang berbeda selama 14 hari, mencari metabolit dengan korelasi serupa dengan µd dan/atau qP antara titik waktu.
Metode hierarkis menunjukkan banyak metabolit yang secara konsisten terkait dengan µd dan/atau qP yang terlewatkan oleh pemodelan OPLS global konvensional. Pendekatan baru ini juga menghindari penandaan metabolit dengan hubungan yang tidak konsisten sebagai signifikan, tidak seperti metode global. µd dan qP berhubungan terbalik: sebagian besar metabolit berhubungan positif dengan yang satu dan negatif dengan yang lain, yang mencerminkan hubungan antara viabilitas sel dan produksi mAb. Jalur utama menyangkut metabolisme karbohidrat (siklus TCA, piruvat, glioksilat, pantotenat). Metabolisme asam amino juga disorot sebagai hal penting, namun korelasinya tidak jelas, terutama disebabkan oleh adanya asam amino dalam pakan, sehingga diperlukan kehati-hatian saat menganalisis perubahan kadar asam amino dalam kultur fed-batch.
Studi kami difokuskan pada metabolom ekstraseluler, yang memang memiliki relevansi terbatas terhadap proses intraseluler. Demikian pula, metabolomik intraseluler tidak dapat menggambarkan dinamika metabolisme ekstraseluler secara memadai. Sebagian besar studi mengeksplorasi metabolomik intra atau ekstraseluler, sehingga mengintegrasikan kedua sisi dapat memberikan pemahaman yang lebih holistik tentang metabolisme seluler selama produksi bioproses. Yang penting, metabolit dalam studi kami yang hanya disorot oleh metode hierarkis relevan secara biologis. Beberapa di antaranya sebelumnya dijelaskan sebagai relevan untuk kematian atau produktivitas sel, tetapi yang lain belum pernah dilaporkan dalam literatur CHO sebelumnya, yang menunjukkan manfaat metode baru. Kami berharap temuan kami berkontribusi pada pemahaman yang lebih baik tentang produksi biofarmasi dan untuk meningkatkan bioproses untuk obat-obatan yang lebih murah dan lebih aman.
Leave a Reply